I januari 1569 erkändes Johan III som kung av samma riksdag som tvingade Erik XIV bort från tronen. Men detta erkännande gavs inte utan medgivanden från Johans sida: hertig Karl fick bekräftelse på sitt hertigdöme utan de inskränkningar i hans makt som Arboga artiklar lagförde, åt adeln gavs förmåner som i fråga om utvidgning av dess rättigheter och begränsande av dess skyldigheter gör en betydelesefull tidpunkt i adelns historia, och särskilda förmåner gavs åt den högre adeln som befäste och utvecklade den skillnad mellan adelns olika klasser som i svenska adelns historia är av så genomgripande betydelse. Trots allt detta ansåg sig Johan III inte sitta säker på sin tron så länge hans tillfångatagne bror levde. Fruktan för en eventuell befrielse av honom oroade kungen ständigt (jämför Erik XIV) och förmådde honom att redan 1571 ge vakterna order om att i händelse av minsta fara för något eller liknande att mörda den tillfångatagne kungen, och troligen var det till följd av en sådan befallning som Erik XIV:s liv ändades 1577. Även om så inte var fallet står det faktum kvar att Johan III inte drog sig för ett eventuellt mord på sin bror och att det inte var mot hans vilja om det utfördes.
Johan III liknade ofta sig vid sin fader i propagandasyfte, och speciellt försökte han framhäva att medan denne skulle ha ”befriat Sverige” från ”blodhunden” Kristian II, så hade han räddat befolkningen från den ”tyranniske” Erik XIV. Han hade vissa liknande egenskaper som sin far och sina bröder, våldsam, med ett häftigt temperament och en stor misstänksamhet. Men skarpsyntheten, fastheten, försiktigheten och den praktiska blicken saknades fullkomligt.
Johan lät med tiden sin son Sigismund övergå till den katolska kyrkan, troligen i syfte att hjälpa honom förvärva Polens krona. Syftet vanns 1587, och Johan III hade därmed berett Sverige en ny union, onaturligare än den som fadern sönderslitit, då Sverige och Polen ofta hade direkt motstridiga intressen i Baltikum. Han kom även snart att ångra sig och krävde fåfängt att få tillbaka Sigismund till Sverige, något högadeln motsatte sig då de såg framför sig att detta skulle leda till krig med Polen, något Sverige efter 28 år av krig skulle ha svårt att klara. Johan svarade med en politisk rockad; istället för att som tidigare stödja sig på rådsaristokratin sökte han nu bistånd hos sin bror hertig Karl, med vilken han under större delen av sin föregående regering levat i bitter strid. Anledningarna därtill hade varit många, men en av de huvudsakligaste hade varit att Johan III som kung sökt tillämpa samma grundsatser med avseende på de kungliga rättigheterna inom Karls furstendöme som han som hertig hade så ivrigt bekämpat. År 1587 hade han slutligen lyckats förmå brodern att godkänna stadganden som mycket påminna om de 1569 av honom själv upphävda Arboga artiklar, men att döma av ett förslag (1590) till nytt ordnande av de furstliga rättigheterna uppgav han efter brytningen med högadeln handlöst de fordringar som han förut envist fasthållit. Även den nyvunna vänskapen med Karl svalnade dock snart, och under de sista månaderna av sitt liv stod Johan III fullkomligt ensam. Han dog i Stockholm den 17 november 1592, lämnande sitt rike försvagat av yttre krig och inre strider, av oordning och vanvård samt för den närmaste framtiden hotat av de största faror. Johan III ligger begraven i Uppsala domkyrka.
Som kung var Johan orienterad mot Baltikum, med mål att ta kontroll över den rika handeln på Ryssland. Efter att 1570 ha avslutat nordiska sjuårskriget och slutit fred med Danmark och Lübeck startade han krig med Ryssland. Det kriget varade med varierande intensitet ända till hans död. Intagandet av Narva år 1581 var hans största militära framgång.